根瘤菌与豆科植物共生形成根瘤，它们将大气中的游离氮转化为植物能够直接吸收的氨或其它氮化合物，根瘤固氮为大豆全生长周期提供60-70%的氮素来源。因此充分利用豆科植物的固氮机能，减少化学氮肥的施用，是未来绿色农业发展的方向。根瘤的发育过程是有序且精细的，根据发育类型，它们主要分为两类：不定型根瘤和定型根瘤。这两类根瘤的主要区别在于是否存在细胞分区以及是否具有持续活跃的顶端分生组织。苜蓿和豌豆的不定型根瘤呈椭球形，根瘤尖端到基部存在明显分区，尖端分生区域干细胞活性高，根瘤维持极性生长；大豆和百脉根的定型根瘤呈球形，根瘤无分区，且根瘤生长到一定阶段分生区干细胞消失，细胞仅膨大而停止分裂。豆科植物根瘤的固氮能力与根瘤尖端分生区的干细胞存在时长呈正相关。尽管科学界对定形根瘤与不定形根瘤在区域化特征上的差异已有初步了解，但这些差异背后的深层机制和确切原因尚未解析。
2024年7月24日，福建农林大学陈栩教授团队在Cell Press细胞出版社期刊《发育细胞》Developmental Cell上发表了题为“Soybean symbiotic-nodule zonation and cell differentiation are defined by NIN2 signaling and GH3-dependent auxin homeostasis”（NIN2-GH3协调的生长素稳态控制大豆根瘤细胞的分区和分化机制）的研究论文。该研究对发育中的大豆根瘤进行了细胞类型的重新划分，明确了定型根瘤也存在类似于不定型根瘤的分区：皮层区（Nodule apex）、前侵染区（Pre-infection zone）、侵染区（Infection zone）以及固氮区（Nitrogen-fixation zone）。该研究发现，大豆根瘤的前侵染区是细胞分裂旺盛的区域，生长素含量较高，且生长素浓度梯度是控制大豆根瘤分区的主要因素。高浓度的生长素维持前侵染区的干细胞活性，抑制细胞分化为固氮区细胞。GRETCHEN HAGEN 3 (GH3) 酰基酰胺合成酶介导生长素从活性的游离态形式转变为非活性的螯合态，是控制前侵染区和侵染区分化为固氮区的核心基因。伴随大豆根瘤的发育，固氮共生的关键转录因子NIN2a能够激活GH3.1的表达，通过降低生长素的浓度来促进根瘤细胞的分化。此外，伴随根瘤菌的不断入侵，生长素水平升高，能够促进NIN2a蛋白的积累，并增强其激活GH3.1表达的能力，从而进一步失活生长素，最终导致大豆根瘤前侵染区和侵染区的消失。这项研究揭示了NIN2a-GH3-生长素分子模块是控制定型根瘤分区的关键模块，并为理解植物物种间细胞分化的更广泛机制提供了宝贵的见解。
首先，该研究团队采用细胞染色、三维模拟根瘤细胞结构以及透射电镜观察等方法，对4至14天接种根瘤菌后的大豆根瘤进行了细致分析。根据细胞大小，将接种根瘤菌11天后的根瘤划分为四个区域：皮层区、前侵染区、侵染区和固氮区。通过使用IAA抗体检测和生长素代谢测定，研究团队发现生长素在根瘤的前侵染区和侵染区积累，并随着根瘤逐渐成熟，生长素信号与根瘤分区同步消失，这暗示了生长素水平与根瘤侵染区的存在可能存在正相关。
图1 大豆根瘤不同发育时期的形态学观测和生长素分布检测
进一步地，通过时空转录组分析和共表达网络分析，研究团队发现生长素代谢途径是控制根瘤成熟的核心模块，生长素酰胺合成酶GH3.1及其同源基因GH3.13和GH3.26与固氮的核心转录因子NINs、NF-YA等呈现共表达模式。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除GH3基因，获得的gh3四突突变体的根瘤表现出高生长素水平和增厚的前侵染区，前侵染区的长期存在阻滞了根瘤细胞的分化和成熟，导致突变体根瘤的固氮酶活下降而根瘤酶活延续时间较为持久。
通过显微切割技术联合转录组分析，研究者进一步确认gh3四突突变体的根瘤中，高积累的生长素导致了密集排列的未分化细胞，这些细胞维持了前侵染区的存在，使得大豆定型根瘤具备了苜蓿不定型根瘤较为持久的干细胞能力。深入研究表明，在大豆根瘤正常发育过程中，共生因子NIN2a直接结合GH3.1的启动子并激活其表达，在根瘤侵染区迅速螯合高浓度的生长素。活性生长素的快速下降造成前侵染区的消失，并促进前侵染区细胞分化为固氮细胞。伴随根瘤的成熟，根瘤菌的不断增殖带来高浓度的生长素，这些生长素能够促进NIN2a蛋白的凝聚和蛋白富集，从而进一步激活NIN2a-GH3-生长素螯合信号，加快了大豆根瘤前侵染区的消失。这些研究结果不仅揭示了生长素在根瘤成熟过程中的关键作用，打破了定型根瘤不存在分区的传统认知，而且为高固氮活性的大豆根瘤改造提供了新的视角。
图2 NIN2a–GH3–auxin协调大豆分区消失的模型
陈栩团队将继续围绕大豆根瘤分区的改良，干细胞区域的维持，响应外界环境刺激后根瘤分区和细胞分化的响应机制展开深入研究。并在上述基础研究的基础上，将固氮酶活改良后的基因编辑型大豆落实于大田复合种植体系中，测试化学氮肥少施用后的效果。这一研究方向有望为培育具备高固氮效率的大豆新品种提供基因资源，也将为可持续农业生产提供重要的研究方法。
福建农林大学未来技术学院 海峡联合研究院涂田莉讲师和高震副教授为论文共同第一作者，陈栩教授为通讯作者。中国科学院分子卓越中心的谢芳教授和广州大学的关跃峰教授也参与了此项工作。该研究得到国家自然科学基金优秀青年基金项目（32222009），国家重点研发项目（2022YFA0912100）以及福建省自然科学基金重点项目（2021J02011）的资助。